运动神经元存活基因1（SMN1）检测试剂盒体外诊断试剂产品注册技术审评报告（2026年淦江生物版）

一、产品概述

　　(一)产品主要组成成分

　　本试剂盒由 2个扩增试剂(SMN1-扩增反应液、SMN1-引物探针混合液)和 4 个对照品(SMN1-空白对照品、SMN1-0拷贝对照品、SMN1-1拷贝对照品、SMN1-2拷贝对照品)组成。

　　主要组成成分如下：

　　表1：试剂盒主要组成成分

组成	组分名称	主要成分	装量
扩增试剂	SMN1-扩增反应液	适体修饰热启动酶、UDG 酶、 dNTPs、dUTP、氯化镁、D-（+）- 海藻糖、Tris-HCl、无脂肪酸牛血 清白蛋白、吐温20、硫酸铵	320 μL/管×1 管
	SMN1-引物探针混合液	引物、探针（2 条分别由FAM、 HEX 标记的荧光探针；3 条淬灭探 针；1 条Blocker 探针）、TE 缓冲 液	256 μL/管×1 管
对照品	SMN1-空白对照品	Tris-HCl	100 μL/管×1 管
	SMN1-0 拷贝对照品	Chr9 参考区序列合成质粒、TE 缓 冲液	40 μL/管×1 管
	SMN1-1 拷贝对照品	SMN1 外显子7 和外显子8区域合 成质粒、Chr9 参考区序列合成质 粒、TE 缓冲液	40 μL/管×1 管
	SMN1-2 拷贝对照品	SMN1 正常型细胞系基因组DNA、TE 缓冲液	40 μL/管×1 管

　　(二)产品预期用途

　　本试剂盒用于体外定性检测人EDTA抗凝全血样本基因组DNA中的运动神经元存活基因1(SMN1)外显子7 和外显子8的拷贝数变异。

　　检测结果用于脊髓性肌萎缩症(Spinalmuscularatrophy,SMA)的辅助诊断。不作为患者病情评价的唯一标准，医生应结合患者临床表现及其他检测信息对患者病情进行综合判断。

　　(三)产品包装规格

　　32 测试/盒。

　　(四)产品检验原理

　　本产品采用荧光PCR熔解曲线分析技术，在同一反应管内同时检测受检者SMN1基因外显子7和外显子8 的拷贝数变异。

　　SMN1 基因(NG_008691.1)包含8 个外显子(Exon1,2a,2b,3~8;NM_000344.3)，以内含子6、外显子7、内含子7 和外显子 8的序列为检测靶区，并经序列比对及筛选，选择9号染色体(Chr9)上的一段同源序列作为检测参考区。基于检测靶区、参考区以及 SMN2基因(NG_008728.1)的同源区序列特征进行特异性的引物及探针设计，可在排除 SMN2基因干扰的情况下进行SMN1 基因外显子7 和外显子8的拷贝数检测。

　　针对外显子7(TargetsequenceofExon7, E7-tar)的检测，基于外显子7 上c.840C>T 及内含子7 上c.888+100A>G 位点进行ARMS(AmplificationRefractoryMutationSystem，扩增阻滞突变系统)引物设计，上游引物及下游引物的 3’末端碱基均与SMN1匹配而不与 SMN2匹配，并通过进一步在引物 3’末端倒数第 2或 3位引入额外的错配碱基，使得引物仅扩增 SMN1，而不扩增SMN2。针对Chr9 参考区序列(Referencesequenceof Exon7,E7-ref)，与 SMN1 使用共同的下游引物，并设计了特异的上游引物对参考区序列进行扩增。E7-tar靶区及 E7-ref参考区使用相同的荧光探针和淬灭探针进行检测。

　　针对外显子8(TargetsequenceofExon8, E8-tar)检测，基于外显子8 上c.*239G>A 位点进行上游ARMS引物设计，引物的3’末端碱基与SMN1匹配而不与SMN2匹配，进一步的在引物3’末端倒数第2 或3 位引入额外的错配碱基增加引物扩增的特异性，同时针对 SMN2基因设计了特异的 Blocker探针，因此即使在使用相同下游引物的情况下，也能仅扩增 SMN1，而不对 SMN2 进行扩增。针对Chr9 参考区序列(Reference sequenceofExon8,E8-ref)，与 SMN1 使用通用的下游引物，并设计了特异的上游引物对参考区序列进行扩增。E8-tar靶区及 E8-ref参考区使用相同的荧光探针和不同的淬灭探针进行检测。

　　本产品使用经特殊设计的引物，通过不对称PCR技术扩增可在同一反应内获得包含 SMN1 外显子 7检测靶区及参考区(E7-tar& E7-ref)、外显子8 检测靶区和参考区(E8-tar& E8-ref)的单链目标 DNA片段;根据靶区和参考区碱基差异设计特异性的荧光探针和淬灭探针，通过探针与单链目标 DNA片段杂交并进行熔解曲线分析，当探针靶区或参考区的靶序列杂交时，由于碱基匹配程度不同，形成双链 DNA的稳定性也各不相同，其熔点值(Tm)值因此也存在差异，当检测靶区域(E7-tar和/或 E8-tar)发生拷贝数缺失，靶区域与同源参考区域的模板量比例发生改变，扩增产物也相应发生改变，导致相应熔解峰高度同比例改变，从而根据不同 Tm值熔解峰强度比例改变，计算RmRatio(R值)及CNVRatio(C值)，并据此判定外显子7 和/或外显子8的拷贝数。

　　本试剂盒设置了0 拷贝、1 拷贝、2 拷贝及空白对照品，可减少假阴性和假阳性的出现。本试剂盒设置了 UDG酶防污染体系，UDG酶防污染体系的原理是：在PCR反应中加入dUTP替代dTTP，形成了含dU碱基的PCR产物，UDG酶能选择性断裂单链和双链DNA中dU碱基的糖苷键，降解含dU的PCR扩增产物。UDG酶的最佳活性温度为50℃,95℃处理2~10min可对其进行灭活。

二、临床前研究概述

　　(一)主要原材料

　　1.主要原材料的选择

　　本产品的主要原材料包括引物、探针、dNTPs、dUTP、UDG酶、热启动酶、质粒及细胞基因组 DNA，均通过外购的方式获得。其中引物、探针的序列由申请人自行设计后由合成公司经过合成、修饰、纯化后获得;质粒插入序列由申请人自行设计，由合成公司合成，并经过构建载体、转化质粒、提取质粒获得。

　　申请人对主要原材料的供应商进行了选择，通过功能性试验筛选出合格供应商，制定了各主要原材料的技术要求和质量标准并经检验合格。

　　2.企业参考品及对照品的设置

　　本产品的企业参考品包括准确性参考品、检测限参考品、精密度参考品和特异性参考品。

　　企业参考品采用临床血液样本 DNA、人工质粒或临床血液样本DNA中添加人工质粒DNA制备。所有临床血液样本均通过MLPA技术确认SMN1 基因拷贝数。

　　试剂盒同时设置了 SMN1-空白对照品、SMN1-0拷贝对照品、SMN1-1拷贝对照品、SMN1-2拷贝对照品，用于检测过程的质量控制，其中 SMN1-2拷贝对照品也用于检测结果的计算分析。SMN1-2 拷贝对照品主要原料为细胞基因组 DNA，SMN1-0拷贝对照品和 SMN1-1 拷贝对照品主要原材料为质粒DNA，SMN1-空白对照品主要原料为Tris-HCl缓冲液。

　　(二)生产工艺及反应体系研究

　　反应体系研究进行了适用样本、PCR反应体系、PCR反应程序以及结果判读方式的研究。

　　适用样本的研究包括样本的类型、样本的保存以及核酸提取纯化试剂性能的研究。PCR反应体系研究，包括对样本用量、SMN1-扩增反应液用量、SMN1-引物探针混合液用量、反应总体积的研究。PCR反应程序的研究针对核心步骤变性/退火延伸阶段的重要参数退火延伸温度、退火延伸时间、扩增循环数进行了优化测试，同时也对熔解曲线分析的峰高阈值进行了研究。结果判读方式的研究，包括待检样本C 值计算公式的研究及根据C 值进行拷贝数判定的研究。

　　申请人对试剂盒中各个组分的主要生产工艺进行了研究，确定了最佳的生产工艺。

　　(三)分析性能评估

　　本产品分析性能评估内容包括准确度、精密度、检出限、分析特异性和核酸提取试剂性能的研究。

　　1.准确度

　　使用三批次试剂对临床样本进行检测，检测样本包含低、中、高DNA浓度水平，不同SMN1 基因拷贝数(0、1、2 拷贝及以上)。本试剂与对比试剂检测结果的拷贝数一致，各型别符合率和总符合率均为100%。

　　2. 精密度

　　使用三批次试剂盒对产品精密度进行研究，采用不同拷贝数的临床样本或混合样本(SMN1 基因0 拷贝样本、1 拷贝样本、2拷贝或以上样本)，在检出限浓度和中/高浓度水平，对试剂盒批内、批间、日内、日间、操作者间、仪器间、试剂批次间、室内精密度和室间精密度进行了评价，SMN1基因外显子 7 和外显子8的C值的批内精密度变异系数(CV,%)均≤10%、批间精密度变异系数(CV, %)均≤15%，且检测结果符合预期。

　　3. 检出限

　　使用三批试剂盒对不同SMN1拷贝数(0、1、2拷贝或以上)的临床样本进行检测，提取基因组 DNA，梯度稀释后进行重复检测，对检测限进行初步评估。依据预估结果，在细化的浓度梯度下对每个浓度重复20次检测，选取与预期结果一致率≥95%的最低浓度作为最低检出限，并进一步验证。最终得出试剂盒的最低检测限为2ng/μL，最高检测浓度确定为180ng/μL。

　　本试剂盒建议的检测 SMN1基因拷贝数变异的人基因组DNA 浓度范围为2ng/ μL~180ng/ μL。

　　4. 分析特异性

　　干扰试验研究中，申请人使用制备的内、外源干扰物质样本对三个批次试剂盒的特异性进行了研究。研究结果表明：血液中常见的内外源性干扰物质如200mg/mL血红蛋白、30mg/mL甘油三酯、200mg/L 胆红素、60mg/mL白蛋白、20mg/mL氯化血红素、15mg/mLEDTA-2K·2H2O、15mg/mL EDTA-3K·2H2O 、15mg/mLEDTA-2Na·2H2O 、150μg/mL阿莫西林三水物、150μg/mL对乙酰氨基酚、15μg/mL奥美拉唑;1μg/mL异丙托溴铵一水合物、10μg/mL阿奇霉素和10μg/mL磷酸奥司他韦在设定浓度下不会干扰试剂盒检测结果，对试剂盒检测性能无明显影响。

　　交叉反应研究中，申请人使用制备的交叉反应样本对三个批次试剂盒的特异性进行了研究。研究结果表明：试剂盒检测基因范围外的核酸序列相近或具有同源性序列不会干扰试剂盒的检测结果，如与常见的血源性病原体乙型肝炎病毒(9.2*105IU/mL)、丙型肝炎病毒(8.8*104IU/mL)、人类疱疹病毒3(6.4*103copies/mL)、金黄色葡萄球菌(5*106copies/mL)、大肠杆菌(5*106copies/mL)、铜绿假单胞菌(5*106copies/mL)、肺炎链球菌(5*106copies/mL)、新型冠状病毒(2*104copies/mL)等均不发生交叉反应。试剂盒与检测范围外的其他 SMN1微小突变c.463_464delAA 、c.683T>A 、c.689C>T 、c.22dupA 、 c.123dupA等均不发生交叉反应;4 拷贝或5 拷贝的SMN2 基因不影响试剂盒对SMN1基因外显子7和外显子8拷贝数的判读;SMN1: c.835-5T>G 突变可能会被判读为SMN1 外显子7阳性。

　　(四)阳性判断值研究

　　阳性判断值研究分为建立和验证两部分，纳入 254例人EDTA抗凝全血样本(包含SMN1基因0、1、2拷贝或以上不同拷贝数)。所有样本均使用对比试剂或金标准MLPA方法确认其SMN1 基因拷贝数。

　　对EDTA抗凝全血样本SMN1 基因的7号外显子和8号外显子的拷贝数进行检测，收集各样本的FAM通道和HEX通道的 Tm值、Rm值数据，并根据说明书中的方法进行 E7R值、E8R 值、E7C值、E8C值的计算。结合各样本赋值的SMN1 基因外显子 7 和外显子 8 的拷贝数结果，使用受试者工作特征(ROC)曲线法对外显子7 的E7C 值和外显子8 的E8C 值的阳性判断值进行了研究确认。

　　1. SMN1 外显子7 拷贝数判定

　　表2：SMN1 外显子7 拷贝数判定标准

位点	E7C 值	拷贝数
SMN1 外显子7	E7C 值=0	0 拷贝
	0.20≤E7C 值≤0.75	1 拷贝
	E7C 值≥0.79	2 拷贝或以上

　　2. SMN1 外显子8 拷贝数判定

　　表3：SMN1 外显子8 拷贝数判定标准

位点	E8C 值	拷贝数
SMN1 外显子8	E8C 值=0	0 拷贝
	0.30≤E8C 值≤0.86	1 拷贝
	E8C 值≥0.89	2 拷贝或以上

　　(五)稳定性研究

　　申请人对产品的稳定性研究包括实时稳定性、运输稳定性、使用稳定性(开瓶稳定性、冻融稳定性)。

　　实时稳定性：将三批试剂盒置于-20±5℃下避光保存，分别在0个月、3个月、6个月、8个月、10个月、12个月和 14个月，使用企业参考品依据产品技术要求进行全性能检测。研究结果表明在-20±5℃避光保存至第14个月时试剂盒仍能保持其性能;最终确定产品的实时稳定性为12 个月。

　　此外，申请人对产品的运输稳定性、使用稳定性分别进行了研究。结果显示，产品的性能均满足产品说明书的声称。

三、临床评价概述

　　申请人在深圳市儿童医院、河北医科大学第二医院和河南省儿童医院共三家临床机构完成了临床试验。采用试验体外诊断试剂与已上市同类产品进行比较研究，对产品临床性能进行评价。临床试验共入组受试者 780例，包括 SMA患者、疑似SMA有相似症状或体征的其他疾病患者(如：先天性肌病、杜氏肌营养不良、代谢性肌病、肌无力)及部分有家族史的受试者等，样本类型为抗凝全血样本。SMN1基因第 7外显子 0拷贝样本152 例，1 拷贝样本111 例，2 拷贝或以上样本517 例;SMN1 基因第8 外显子0 拷贝样本133 例，1 拷贝样本123 例，2 拷贝或以上样本524 例。

　　试验结果显示，试验体外诊断试剂与对比试剂检测 SMN1基因第 7 外显子 0 拷贝符合率为100%(95%CI：97.53%，100%)，1 拷贝符合率为99.10%(95%CI：95.07%，99.84%)，2拷贝或以上符合率为 99.81%(95%CI：98.91%，99.97%);

　　检测 SMN1基因第 8外显子 0拷贝符合率为100%(95%CI：97.19%，100%)，1拷贝符合率为100%(95%CI：96.97%， 100%)，2拷贝或以上符合率为 99.81%(95%CI：98.93%，99.97%)。针对不一致样本，均结合MLPA方法进行了确认。试验体外诊断试剂与对比试剂检测一致性良好。

　　同时采用试验体外诊断试剂与 SMA的临床诊断结果进行了比较研究。临床诊断结果为SMA病例157 例，非SMA病例623例，试验结果显示：灵敏度为 96.18%(95%CI：91.91%，98.24%);特异度为 99.84%(95%CI：99.10%，99.97%)。针对不一致的样本进行了充分分析和确认，其中假阴性的 6例患者均为复合杂合突变型的SMA患者，其中1 例患者是SMN1双等位基因均为微小变异([1d+1d])的复合杂合突变的 SMA患者;假阳性样本 1 例，该患者最终确诊为 SMAIII型患者。上述结果显示两者之间具有良好的一致性，本产品针对 SMA辅助诊断的临床性能满足要求。

　　综上所述，该产品临床试验资料符合技术审评要求。

四、产品受益风险判定

　　申请人参照YY/T0316-2016《医疗器械风险管理对医疗器械的应用》对医疗器械产品的安全风险进行了分析。

　　(一)受益评估

　　本试剂盒用于体外定性检测人EDTA抗凝全血样本基因组DNA中的运动神经元存活基因1(SMN1)外显子7 和外显子8的拷贝数变异。

　　检测结果用于脊髓性肌萎缩症(Spinal muscularatrophy,SMA)的辅助诊断。不作为患者病情评价的唯一标准，医生应结合患者临床表现及其他检测信息对患者病情进行综合判断。

　　本产品临床应用的主要受益在于：可作为脊髓性肌萎缩症的辅助诊断的方法。

　　(二)风险评估

　　根据申请人提供的申报资料，经综合评价，在目前认知水平上，认为该产品上市带来的受益大于风险。但为保证用械安全，基于对主要剩余风险的规避，已在本产品说明书中提示以下信息：

　　1.预期用途：本试剂盒用于体外定性检测人 EDTA抗凝全血样本基因组DNA中的运动神经元存活基因1(SMN1)外显子7和外显子 8的拷贝数变异。检测结果用于脊髓性肌萎缩症的辅助诊断，不作为患者病情评价的唯一标准，医生应结合患者临床表现及其他检测信息对患者病情进行综合判断。

　　2.警示及注意事项：产品说明书中明确了该产品检验方法的局限性及使用中的注意事项。