甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测试剂盒 （PCR-荧光探针法）说明书

【产品名称】

　　通用名称：甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)

【包装规格】

　　单管单人份，48 人份/盒;大包装，48 人份/盒;大包装，24 人份/盒。

【预期用途】

　　本试剂盒用于体外定性检测具有新型冠状病毒感染相关症状人群、其他需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者的咽拭子样本中，新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF1ab 和 N 基因以及甲型/乙型流感病毒(FluA/B)核酸。本试剂盒检测结果应结合流行病学史、临床表现、其他实验室检查等进行综合分析，作出诊断。

　　该产品在使用上应当遵守新型冠状病毒感染诊疗方案等文件的相关要求。

　　开展新型冠状病毒核酸检测，应符合新冠病毒样本采集和检测技术相关指南的要求，做好生物安全工作。

　　临床使用中如需区分 2019 新型冠状病毒单基因检测情况，应另外选择可区分 ORF1ab、N 基因的试剂进行检测。

【检验原理】

　　本试剂盒基于一步法 RT-PCR 技术，以甲型流感病毒 M 区、乙型流感病毒 M 区、2019 新型冠状病毒 N 和 ORF1ab 的高度保守区为靶区域，分别设计特异性引物及荧光探针，配以逆转录酶和热启动酶等成份组成核酸扩增试剂，使用荧光 PCR 仪进行 PCR 扩增，并检测荧光信号，实现未知样本中甲型流感病毒(FAM)、乙型流感病毒(Texas Red)、2019 新型冠状病毒(VIC)的定性检测。同时，以人类管家基因为内标(CY5)，设计特异性引物和探针进行扩增，可对样本采集和核酸提取过程进行监控，减少假阴性结果的出现。

【主要组成成分】

　　本试剂盒不包含但建议推荐使用的配套提取试剂：本公司生产的核酸提取或纯化试剂(磁珠法：粤穗械备 20170583 号或粤穗械备 20170668 号;离心柱法：粤穗械备 20170669 号)。本试剂盒不包含但建议推荐使用的配套保存液/采样液：深圳市梓健生物科技有限公司生产的一次性使用病毒采样管(粤深械备 20190041 号)、深圳市华晨阳科技有限公司生产的一次性使用病毒采样管(粤深械备 20180466 号)、友康恒业生物科技(北京)有限公司生产的病毒采样试剂盒(京械注准 20182400236)、广州邦德盛生物科技有限公司生产的样本保存液(粤穗械备 20160299 号)、生理盐水。

　　质控品说明：A/B/nC阳性质控品为含有甲型流感病毒、乙型流感病毒、2019新型冠状病毒和内标GAPDH假病毒混合液，A/B/nC阴性质控品为含有内标GAPDH目的片段的假病毒，不具有传染性。但使用时均需参与核酸提取，操作时应视为潜在的传染物质，操作和处理均需符合相关法规要求。

【储存条件及有效期】

　　试剂盒保存于-20±5℃，有效期 9 个月。

　　试剂盒避免反复冻融，反复冻融次数不超过 4 次;开瓶次数不超过 4 次;-20±5℃条件下运输时间不应超过 7 天。

　　试剂盒生产日期及有效期见产品标签。

【适用仪器】

　　ABI 7500。

【样本要求】

　　1. 适用样本类型：

　　咽拭子样本。

　　2. 样本采集

　　将拭子越过舌根，在被采集者两侧扁桃体稍微用力来回擦拭至少 3 次，然后再在咽后壁上下擦拭至少 3 次，将拭子头浸入下表所示含保存液/采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。

　　3. 样本保存

　　所采集的样本可立即用于测试，也可置于 2~8℃保存 24 小时内完成检测;-20±5℃条件下可以保存 10 天;-70℃或以下可以保存 12 个月。样本应避免反复冻融，冻融次数不超过 5 次。提取后的核酸在-20±5℃可以保存 6 个月，在-70±5℃可以保存12 个月。

【检验方法】

　　1. 样本处理和核酸提取(样本处理区)

　　取 200 μL 液体样本进行核酸提取。可采用本公司生产的核酸提取或纯化试剂(磁珠法：粤穗械备 20170583 号或粤穗械备20170668 号;离心柱法：粤穗械备 20170669 号);3 种核酸提取或纯化试剂洗脱体积均为 100μL，具体操作步骤请按照试剂盒说明书指引进行。

　　本试剂盒中的 A/B/nC 阴性质控品和 A/B/nC 阳性质控品均应参与提取。

　　2. PCR 试剂准备(试剂准备区)

　　2.1 大包装规格试剂使用：

　　从试剂盒中取出 A/B/nC PCR 反应液 A 和 A/B/nC PCR 反应液 B，室温融化后振荡混匀，8,000 rpm 离心数秒后使用。取 N个(N=待测样本个数+A/B/nC 阴性质控品+A/B/nC 阳性质控品)PCR 反应管。A/B/nC 单人份扩增体系配制如下表：

　　将各组分充分混合后进行短时离心，以使管壁上的液体全部离心至管底，之后将 20 µL 扩增体系分装到 PCR 管中。

　　2.2 单管单人份规格试剂使用：直接使用 A/B/nC PCR 反应管。

　　3. 加样(样本制备区)

　　往上述 PCR 反应管中分别加入 5 µL 提取后的 A/B/nC 阴性质控品、待测样本核酸、A/B/nC 阳性质控品，盖紧管盖，8,000 rpm瞬时离心后转移至扩增检测区。

　　4. PCR 扩增(扩增检测区)

　　4.1 将反应管放入仪器样品槽内。

　　4.2 ABI 7500 仪器设置

　　4.2.1 打开“Setup”窗口，按样本对应顺序设置阴性质控品、阳性质控品以及未知样本(Unknown)，并在“Sample Name”一栏中设置样本名称;探针检测模式设置为：Reporter1：FAM，Quencher 1：NONE;Reporter 2：VIC，Quencher 2：NONE; Reporter3：Texas Red，Quencher3：NONE;Reporter4：CY5，Quencher4：NONE; Passive Reference：NONE。

　　4.2.2 打开 instrument 窗口，设置循环条件如下：反应体系为 25µL。

　　设置完成后，保存文件，运行程序。

　　5. 结果分析

　　反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，在Log图谱窗口设置Threshold的Value值，使阈值线位于扩增曲线指数期)，点击 Analysis 自动获得分析结果，在“Report”窗口读取检测结果。

　　6.质量控制

　　6.1 A/B/nC 阴性质控品：CY5 通道存在明显扩增曲线，且 Ct 值≤38，其他通道无扩增曲线;

　　6.2 A/B/nC 阳性质控品：FAM、Texas Red、VIC 检测通道均存在明显扩增曲线，且 Ct 值≤32;CY5 通道有或无扩增曲线;以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

　　7.结果判定

　　样本检测结果，按照下表进行结果判读：

【阳性判断值】

　　根据样本检测结果绘制 ROC 曲线，确定本试剂盒甲型流感病毒、乙型流感病毒、2019 新型冠状病毒的阳性判断值均为 38;利用 T 检验方法统计分析，确定本试剂盒内标基因的阳性判断值为 38。

【检验结果的解释】

　　1.每次实验均需检测 A/B/nC 阴性质控品及 A/B/nC 阳性质控品，结果满足质量控制要求时方可进行检测结果的判断;

　　2.当 FAM 或 Texas Red 或 VIC 检测通道为阳性时，由于体系的竞争关系，内标通道可能为阴性。

　　3.当内标通道为阴性，且该样本 FAM、Texas Red 及 VIC 检测通道也均为阴性，则该样本检测结果无效，应对该样本重新提取核酸后进行复检;若复检结果仍无效，则需重新采集样本进行检测。

【检验方法的局限性】

　　1.本试剂盒最低检测限均为 500copies/mL，样本浓度低于本试剂盒最低检测限时无法检出;

　　2.本试剂盒仅对甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒进行检测，不能检测未在本试剂盒检测范围内的其他呼吸道病原体;

　　3.样本检测结果与样本收集、处理、运送及保存质量有关，不合理的样本采集、转运、储存及处理过程均有可能导致错误的检测结果;

　　4.样本处理时没有控制好交叉污染，可能出现假阳性结果;

　　5.病毒在流行过程中的基因突变则也可能导致假阴性结果;

　　6.本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其它实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

【产品性能指标】

　　1.本试剂盒最低检测限均为 500 copies/mL。

　　2.阴性符合率：对国家阴性参考品或企业阴性参考品进行检测，检测结果应为新型冠状病毒阴性;阴性参考品符合率为 100%。

　　3.阳性符合率：对国家阳性参考品或企业阳性参考品进行检测，检测结果应为阳性;阳性参考品符合率为 100%。

　　4.重复性：统计分析本试剂盒批内、批间、日内、日间、不同操作者之间及不同实验室间 Ct 值的变异系数，结果显示 CV 值均不高于 5%。

　　5.干扰实验：在本试剂盒的实验条件下，样本中可能存在的内源性干扰物质以及外源性干扰物质如 20 μg/mL 粘蛋白、5%(V/V)白细胞、10%(V/V)血液、100 μg/mL 苯福林、100 μg/mL 羟甲唑啉、0.9%氯化钠、100 μg/mL 倍氯美松、100 μg/mL 地塞米松、100 μg/mL 氟尼缩松、100 μg/mL 曲安奈德、100 μg/mL 布地奈德、100 μg/mL 莫米松、100 μg/mL 氟替卡松、100 μg/mL 盐酸组胺、300 U/mL 干扰素、100 μg/mL 扎那米韦、100 μg/mL 利巴韦林、100 μg/mL 奥司他韦、100 μg/mL 帕拉米韦、100 μg/mL 洛匹那韦、100 μg/mL 利托那韦、100 μg/mL 阿比多尔、100 μg/mL 左氧氟沙星、100 μg/mL 阿奇霉素、100 μg/mL 头孢曲松、100 μg/mL美罗培南、100 μg/mL 妥布霉素、100 μg/mL 莫匹罗星、5 mg/mL 苯佐卡因、5 mg/mL 薄荷脑、流感疫苗等不干扰试剂盒检测结果。

　　6.交叉实验：本试剂盒与感染部位相同或感染症状相似的其他病原体，如 5.69×107PFU/mL 冠状病毒 NL63、3.22×107PFU/mL 冠状病毒 OC43、6.14×107 copies/mL 冠状病毒 HKU1、4.02×107PFU/mL 冠状病毒 229E、106 copies/mLSARS 冠状病毒、106 copies/mLMERS 冠状病毒、5.39×107PFU/mL 腺病毒 1 型、9.04×107PFU/mL 腺病毒 2 型、4.66×107PFU/mL 腺病毒 3 型、3.33×107PFU/mL 腺病毒 4 型、5.69×107PFU/mL 腺病毒 5 型、3.93×107PFU/mL 腺病毒 7 型、4.46×107PFU/mL 腺病毒 55 型、9.22×106PFU/mL 人偏肺病毒、4.89×107PFU/mL 副流感病毒 1 型、1.13×107PFU/mL 副流感病毒 2 型、6.03×107PFU/mL 副流感病毒 3 型、3.88×107 copies/mL 诺如病毒、8.61×107PFU/mL 肠道病毒 A 型、7.93×107PFU/mL 肠道病毒 B 型、3.18×107PFU/mL 肠道病毒 C 型、3.94×106PFU/mL 肠道病毒 D 型、7.69×107PFU/mL 呼吸道合胞病毒 A、3.27×107PFU/mL 呼吸道合胞病毒 B 型、106PFU/mL 鼻病毒(A、B、C 组)、7.86×107CFU/mL 肺炎衣原体、9.07×107CFU/mL 流感嗜血杆菌、2.55×107CFU/mL 嗜肺军团菌、4.70×107CFU/mL 结核分枝杆菌、7.90×107CFU/mL 肺炎链球菌、2×107CFU/mL 化脓性链球菌、9.82×106CFU/mL 百日咳杆菌、2.55×107CFU/mL 肺炎支原体、4.19×107CFU/mL 白色念珠菌、2×108CFU/mL 表皮葡萄球菌、6.32×107PFU/mL 麻疹病毒、8.51×106PFU/mL 巨细胞病毒、5.22×107PFU/mL 轮状病毒、7.74×106 copies/mL EB 病毒、7.10×107PFU/mL 水痘-带状疱疹病毒、8.00×106PFU/mL 腮腺炎病毒、6.96×107CFU/mL 金黄色葡萄球菌、3.84×107CFU/mL 肺炎克雷伯菌、9.56×106CFU/mL 烟曲霉、2×106CFU/mL 光滑念珠菌、2×106CFU/mL 新生隐球菌、6.65×107PFU/mL 博卡病毒、3.25×107PFU/mL 单纯疱疹病毒 1 型、4×107CFU/mL 棒状杆菌属、2.61×10 7CFU/mL 乳酸杆菌属、9.13×106CFU/mL 卡他莫拉菌、3.27×107CFU/mL 奈瑟氏菌属、8.75×106CFU/mL 唾液链球菌、6.30×107 copies/mL 肺孢子菌(PCP)以及 50ng/μL 人类基因组 DNA 等无交叉反应。

　　7.包容性：对不同时间、不同区域特征性的不同来源的 H1N1(2009)、季节性 H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、B/Victoria、B/Yamagata、2019-nCoV、2019-nCoV(Alpha 变异株)、2019-nCoV(Delta 变异株)、2019-nCoV Omicron 变异株(BA.2)、2019-nCoV Omicron变异株(BA.4)、2019-nCoV Omicron 变异株(BA.5)进行最低检出限和重复性性能验证，均能正常检出。

　　8.临床试验结果：在 5 家临床单位完成 1018 例样本的临床试验，与已批准上市的同类试剂相比：2019 新型冠状病毒阳性符合率为 100.00%，阴性符合率为 100.00%，总符合率为 100.00%;甲型流感病毒阳性符合率为 100.00%，阴性符合率为 100.00%，总符合率为 100.00%;乙型流感病毒阳性符合率为 99.18%，阴性符合率为 100.00%，总符合率为 99.90%。

【注意事项】

　　1.本产品仅用于体外检测，实验前请仔细阅读本说明书;

　　2.为了避免样本中任何潜在的生物危险，检测样本应视为具有传染性物质，避免接触到皮肤和粘膜;样本的处理应在可防止气雾外流的生物安全柜中操作，样本制备区所用过的试管、吸头需打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃;样本操作和处理均需符合相关法规要求：包括卫生部《病原微生物实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》;

　　3.产物处理：PCR 结束之后，产物容易引起污染，应由当天不再参与实验的人员将所有反应管放入生物安全垃圾处理袋或其他容器中确认完全封闭后方可丢弃;

　　4.全程应避免 RNA 酶和 DNA 酶污染，实验过程中穿工作服，佩戴一次性手套和口罩。在洁净消毒、紫外光杀菌的化学通风橱或生物安全柜完成操作，避免有害物质进入呼吸道;

　　5.使用经高压灭菌的一次性离心管和吸头或购买无 DNA 酶、RNA 酶的离心管和吸头;

　　6.PCR 检测试剂使用前要完全解冻，8,000rpm 离心数秒后使用，但应避免反复冻融;

　　7.如果在样本处理中没有控制好交叉污染，可能出现假阳性;

　　8.实验室管理应严格按照 PCR 基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行(试剂准备区、样本制备区、扩增检测区)，所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用;

　　9.实验完毕用 10%次氯酸或 75%酒精处理工作台和移液器，然后用紫外线灯照射 20-30 分钟;

　　10.须对每次实验进行质量控制。

【参考文献】

　　1. Bil-Lula I, De Franceschi N, Pawlik K, Wozniak M. Improved real-time PCR assay for detection and quantification of all 54 known types of humanadenoviruses in clinical samples. Med Sci Monit. 2012; 18:221-228.

　　2. Hahn A, Wang W, Jaggi P, Dvorchik I, Ramilo O, Koranyi K, et al. Human metapneumovirus infections are associated with severe morbidity inhospitalized children of all ages. Epidemiol Infect. 2013: 1-11.

　　3.Clinical management of severe acute respiratory infection when novel coronavirus (nCoV) infection is suspected—Interim guidance.2020.

　　4.中华医学会, 中华医学会杂志社, 中华医学会全科医学分会等. 急性上呼吸道感染基层诊疗指南(2018 年)[J]. 中华全科医师杂志, 2019, 18(5):422-426.

【基本信息】

　　注册人/生产企业名称：广州达安基因股份有限公司

　　住所：广州市高新技术产业开发区香山路 19 号

　　联系方式：

　　售后服务单位名称：

　　联系方式：

　　生产地址：广州市高新技术产业开发区香山路 19 号、广州市高新技术产业开发区荔枝山路 6 号、广州市黄埔区香山路 17 号 B104

　　号房。

　　生产许可证编号：

　　【医疗器械注册证编号/产品技术要求编号】

　　【说明书核准日期及修改日期】