一文了解遗传性耳聋基因检测试剂盒（PCR-流式荧光杂交法）临床前研究

　　遗传性耳聋是导致听力损失的常见原因之一，尤其在中国人群中，GJB2、SLC26A4、线粒体12S rRNA及GJB3基因突变与非综合征型耳聋密切相关。为了早期发现和干预遗传性耳聋，广州达安基因股份有限公司开发了一款基于PCR-流式荧光杂交法的遗传性耳聋基因检测试剂盒。本试剂盒能够检测新生儿干血斑样本中4个遗传性耳聋基因中的17个关键位点，为遗传性耳聋的辅助诊断提供了新的工具。本文将详细介绍该试剂盒在临床前研究阶段的主要内容，包括主要原材料选择、生产工艺及反应体系优化、分析性能评估等。

1. 主要原材料研究

1.1 原材料选择

　　本产品在制备过程中所用的主要原材料包括引物、探针、热启动Taq酶、dNTPs、UDG酶、微球、LEL dpanti-POS、链霉亲和素藻红蛋白、正常人基因组和耳聋杂合质粒。其中，正常人基因组和耳聋杂合质粒由申请人自行生产，其余原材料均为外购。通过功能性试验筛选出最佳原材料及其供应商，并制定了严格的质量要求以确保原材料的一致性和稳定性。

1.2 企业参考品和质控品设置

　　申请人设计了包含阳性参考品17份、阴性参考品6份、检测限参考品19份、重复性参考品7份的企业参考品，用于评价产品的准确性、检测限、特异性和重复性。这些参考品大多来源于临床新生儿干血斑样本提取的基因组DNA，仅有一份阴性参考品由质粒制备而成。此外，试剂盒还设置了LEL阳性质控品(耳聋杂合质粒)、LEL正常质控品(正常人基因组)和PCR空白对照(纯化水)，用于检测过程中的质量控制。

2. 生产工艺及反应体系研究

　　申请人通过对内部实验数据的分析，确定了最佳的生产工艺及反应体系，包括PCR反应液、酶系、多重微球杂交液、5×显色工作液、显色稀释液和质控品的配液工序、分装工序、组装工序等。同时，对试剂用量、PCR反应条件、提取方法、杂交反应条件、适用仪器、样本核酸浓度以及微球与探针的结合工艺进行了详细研究，以确保试剂盒的稳定性和可靠性。

3. 分析性能评估

3.1 核酸提取或纯化性能

　　申请人评估了配套使用的核酸提取或纯化试剂的效果，验证了其在适用仪器上的表现，结果显示提取的核酸纯度和浓度均满足产品使用需求。

3.2 准确度

　　准确度研究中，申请人使用三批试剂对企业参考品及临床样本进行试验验证，结果表明所有样本的检测结果均符合预期，符合率达到了100%。

3.3 精密度

　　精密度研究涵盖了日内、日间、批内、批间、不同操作者间、不同地点间的重复性及精密度测试。结果显示，所有类型的重复性和精密度均符合要求，变异系数CV值均小于15%，保证了试剂盒的高重复性和一致性。

3.4 检出限

　　检出限研究中，申请人通过梯度稀释样本并进行20次重复检测，最终确定该产品的最低检出限为2 ng/μL。对于线粒体12S rRNA基因的异质率检出限，当样本浓度为2 ng/μL时，线粒体突变样本的异质率为50%。

3.5 分析特异性

　　分析特异性研究包括交叉反应和干扰研究。交叉反应研究表明，申报产品对核酸序列相近或具有同源性的其他突变位点、各基因及突变位点间、非人类基因组和其他耳聋基因样本均无交叉反应。干扰研究表明，即使样本中含有高浓度的胆红素、甘油三酯、血红蛋白、胆固醇和白蛋白等内源性物质，以及复合维生素善存片和血管紧张素转换酶抑制剂类降压药物卡托普利等外源性物质，也不会影响检测结果。

4. 阳性判断值研究

　　申请人采用1886例新生儿干血斑样本，利用ROC曲线法以及百分位数法对阳性判断值进行确定研究，最终确认了各位点不同基因型的阳性判断值参数。进一步的临床样本验证显示，本试剂盒的阳性判断值设立合理，能够准确区分阳性与阴性样本。

5. 稳定性研究

　　申请人对申报产品的实时稳定性、使用稳定性、运输稳定性和样本稳定性进行了全面研究，确定了在各种条件下本试剂盒及样本的有效保存时间。货架有效期(实时稳定性)研究显示，试剂I(PCR扩增试剂)保存于-20±5℃，试剂II(杂交试剂)避光保存于2~8℃，可在实际储存温度条件下稳定保存12个月。此外，使用稳定性、运输稳定性和样本稳定性研究也表明产品的性能满足说明书声称的要求。

结论

　　综上所述，遗传性耳聋基因检测试剂盒(PCR-流式荧光杂交法)在临床前研究中表现出优异的性能，包括高准确性、良好的精密度、低检出限、强特异性和稳定的保存特性。这些特性使得该试剂盒成为一种可靠的工具，可以作为常规物理听力筛查的补充，特别是用于发现常规筛查无法检出的药物性致聋基因携带者和迟发性耳聋基因携带者。未来，随着更多临床应用数据的积累，这款试剂盒有望为遗传性耳聋的早期诊断和干预提供重要的支持。